东华大学何创龙教授团队《ACS Nano》：结构与功能适配仿生骨支架引导组织快速浸润与血管化骨再生

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骨是人体不可分割的一部分，通过自身不断的自修复维持骨量和承重特性。然而，骨的自我修复受制于缺损范围及其生理状况。骨重建是一个复杂的生理过程，涉及多种细胞类型和各种生理因素的相互作用，需要多方协同作用维持骨组织的完整性。相较于传统的治疗方法，骨组织工程成为治疗骨缺损的一种有效策略，但是构建具有结构支撑和再生微环境适配的骨修复材料仍然面临巨大的挑战。

具有多孔的微/纳纤维网络结构生物活性支架因其类似于细胞外基质（ECM），能够促进细胞粘附和增殖等行为，有利于支架与组织的整合，近年来受到研究者们的青睐。与其他支架制备技术相比，3D打印技术在制备几何形状可定制、孔径可控的三维支架方面表现出了优势，然而三维支架较低的力学强度和较弱的成骨能力将限制其在骨修复中的实际应用。理想的人工骨修复材料应该满足以下几个方面的需求：（1）制备的支架材料具有与缺损部位相匹配的个性化形状和ECM样微结构，利于营养物质输送和骨组织生长；（2）具有合适的力学性能和降解速率，为骨重建提供较好的结构支撑；（3）具有足够的血管生成和成骨活性，加速血管化骨再生。

近期，东华大学何创龙教授团队在前期工作基础上（Adv. Funct. Mater., 2022, 32(20): 2200011; Bioact. Mater., 2021, 6(10): 3254-3268；Biomater. Sci., 2021, 9(7): 2631-2646; Chem. Eng. J., 2019, 362: 269-279）, 受“花圃”结构和花卉通过花粉吸引昆虫（例如蜜蜂和蝴蝶）特征的启发，结合3D打印和静电纺技术，构建了以3D打印支架为框架和静电纺纳米纤维为填充物的生物活性支架（DMSNs/SrHA/PGP），兼顾支架的多级微结构、力学强度和生物活性。利用3D打印微丝和纳米纤维分别装载掺锶羟基磷灰石（SrHA）和载有二甲基草酰甘氨酸的介孔硅纳米粒子（DMSNs），通过两者差异的降解速率实现DMOG和Sr离子的顺序释放，促进细胞的迁移和分化，以达到及时的血管化和稳定的骨形成目的，从而促进骨缺损修复（图1）。

图1 DMSNs/SrHA/PGP支架的制备与引导骨组织再生示意图。

SEM与TEM图片显示，SrHA和DMSNs可以均匀地分散在3D打印微丝和纳米纤维中（图2）。从支架的宏观形貌可见，纳米短纤维与3D打印支架的复合具有较好的适用性。同时，纳米纤维穿插在3D打印支架的间隙中，其微结构致密程度与纳米纤维浓度正相关。总之，适宜的纳米纤维浓度（2 wt%）能够为细胞迁移和向内爬行提供结构支持。

图2 （A）不同纳米纤维含量复合支架的制备示意图；（B）复合支架的宏观图片；（C-F）3D 打印微丝与电纺纤维的SEM 与TEM图；（G-I）不同纳米纤维含量（1-4 wt%）复合支架的SEM图。

因纳米纤维成分为明胶和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）复合物以及疏松的多孔结构，所有纳米纤维填充的支架均表现出超好的亲水性（图3）。力学性能测试结果显示，复合支架具有较高的压缩强度（压缩模量为29.85 ± 4.75 MPa）。降解实验表明，12周内DMSNs/SrHA/PGP复合支架中的纳米纤维降解较快，而SrHA@PCL框架没有明显的降解。此外，DMOG呈现早期的快速释放，而Sr离子表现明显的持续释放，这种释放模式有利于刺激早期血管新生和随后的骨生成。

图3 （A-B）支架的元素分析；（C）支架的亲水性；（D-E）支架的力学性能；（F-G）支架的降解性能；（H-I）DMOG和Sr离子的释放。

快速的血管生成能够为骨再生过程提供足够的营养供应，促进新骨的形成和深层骨组织的存活。随后，通过体内包埋实验研究支架的促血管生成能力（图4）。实验结果显示小鼠皮下植入4周后，支架内部呈现明显的组织长入，生成了微血管网络。其中，DMSNs/SrHA/PGP支架中观察到大量的微血管，也具有更高的成血管因子表达。

图4 （A）复合支架的小鼠包埋与评价示意图；（B-C）血管灌注的Micro-CT 成像与定量分析；（D-E）；CD31表达的荧光图片与定量分析；（F-G）HIF-1α表达的荧光图片与定量分析。

在大鼠颅骨构建骨缺损模型，通过micro-CT分析和组织切片染色评价支架的成骨性能（图5）。研究结果显示，DMSNs/SrHA/PGP支架组表现出更多的新骨生成。由于Sr离子和DMOG可协同促进体内骨再生，因此DMSNs/SrHA@PGP支架具有更好的骨再生效果。

图5 （A）复合支架的大鼠颅骨缺损修复示意图；（B-D）体内骨再生的micro-CT重建图片与骨密度和骨体积的定量分析；（E）H&E和Masson染色图片。

为了评估复合支架在颅骨缺损模型中的促血管化能力，通过CD31和α-SMA的免疫荧光染色进行观察。研究发现，DMSNs/SrHA/PGP支架组能观察到更多的CD31和α-SMA表达，表明诱导了更多血管的形成。然后，DMSNs/SrHA@PGP支架组中的OCN表达也显示了更强的荧光信号。此外，通过CD68和CD163的免疫荧光染色评价支架的免疫调节作用。结果显示DMSNs/SrHA@PGP支架组中CD163⁺/CD68⁺巨噬细胞的百分比高于其他组，表明该支架能够调节巨噬细胞表型促进骨组织再生。

图6 （A）CD31、α-SMA和OCN表达的荧光图片；（B）CD68和CD163表达的荧光图片；（C-F）CD31、α-SMA、OCN和CD163⁺/CD68⁺的定量分析。

在本研究中，利用3D打印SrHA@PCL支架作为框架结构，赋予了复合支架较高的力学性能。复合支架内填充的多孔纳米纤维网络不仅促进营养物质运输和组织长入，还通过释放DOMG促进血管形成。此外，结合纳米纤维的较快降解和3D打印微丝的缓慢降解行为，实现了DMOG和Sr离子的可控释放，促进了血管生成和成骨的耦合。综上所述，本研究制备的DMSNs/SrHA@PGP支架可以促进快速的组织浸润和引导血管化骨再生，同时为构建与成骨微环境适配的仿生骨支架提供了一种新策略。

该工作以“Flowerbed-Inspired Biomimetic Scaffold with Rapid Internal Tissue Infiltration and Vascularization Capacity for Bone Repair”为题发表在《ACS Nano》期刊上，论文的通讯作者为东华大学何创龙教授、上海市第九民医院王金武主任医师和上海市第一人民医院马小军副主任医师，第一作者为东华大学周小军博士。该工作得到国家自然科学基金、上海市科委等项目的资助。

原文链接：

https://doi.org/10.1021/acsnano.3c00598

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